灵芝菌种培养和保藏

作者:灵芝 发布于:2013-2-25 14:09 分类:培育种植

1、菌种的分离方法

①将解剖刀,尖的镊子和接种针在酒精灯上烧红后,浸75%的酒精中冷却,取出后再烧红后冷却,反复至少三次,最后一次烧红浸入酒精后稍为在火上晃一下,使残留的酒精燃烧后,冷却后使用。

②将灵芝子实体用手从中间轻轻剥开,避免使菌盖表面或手或其他地方碰到剥开的菌肉,以免杂菌污染。

③用灭过菌的解剖刀轻轻在菌肉中央割几个方块,然后用尖的镊子或接种针取下一块菌肉放入培养皿或斜面试管中,也可直接以尖的镊子夹起一块菌肉放入培养基中,使菌肉直接接触到或者最好半插入培养基,然后封起来恒温培养。接种工具以接种一次为原则,若觉得没有碰到任何可能污染的地方,可以多接种一至两次。如果接触到除了培养基以外的其他地方,则应重新灭菌后再取菌肉,以减少污染。

④分离后的试管或平板应放在恒温箱中培养,观察菌丝是否从菌肉中长出及观察有无其他细菌或霉菌污染,如只从菌肉中长则持续观察到生长旺盛期,这时可以进行大量的繁殖。

2、保藏方法

灵芝是重要的真菌,世界上各个菌种中心如美国菌种保存中心(ATCC)、英国国家微生物研究中心(IMI),荷兰真菌保存中心(CBS),日本大贩发酵研究所(IFO),中国科学院微生物保藏中心等保存有相当数量种类的灵芝菌种。

由于灵芝菌种的细胞核分裂速度快,并且易受环境改变的影响,自然变异的机率大,如未能适当保存,常会发生退化和变异现象而失去原来的优良特性降低其生产量和品质,造成栽培的重大损失。下面介绍几种灵芝菌种的保藏方法。

1)液体石腊覆盖法

①选择营养成份较低的培养基,将灵芝菌种移植生长,直到长满试管。

②将已杀过菌的液体石腊油倒入试管内,栓上螺旋盖子或塞入棉花。

③放置室温或4以下低温保存。

④保存期间应维持干燥,以避免杂菌或昆虫滋生。

2)冷冻干燥保存法

①将已灭过菌的半透膜铺在培养基上,然后接入灵芝菌种,待菌丝长至直径5~8cm

②撕下半透膜,将菌丝移入液体培养基,用果汁机打碎。

③取菌丝片段悬浮液75ml加入300ml液体培养基,并以150rpm振荡培养数天。

④将菌丝团放入300μl12%的含有抗冻剂如海藻糖的脱脂牛奶中,然后以每分钟1缓慢冷冻至-70后,于真空干燥机中真空干燥至含水量低于5%

3)超低温保存法

①将灵芝菌种接种于琼脂培养基上,待长满后取出琼脂块。

②将已长满菌丝的琼脂块移入冷冻小管内,内含10%甘油置于4或室温下静置两小时,使抗冻剂完全渗透进入菌体内。

③以每分钟1缓慢冷冻至-70后,保存于-80或液氮中。

4)继代培养法

①选择适当的培养基,制成斜面试管,将灵芝菌种移植生长。

②每次更新培养基时,最好用适当培养基和营养条件差的培养基轮流替换,以减少因长期生长在营养成分高的培养基造成突变率增高或生理活性降低。

③随时留意贮存期间是否受到污染,棉花塞试管应避免杂菌的侵袭造成污染,如为螺旋试管,则应留意管口是否因湿气而有杂菌滋生。

5)无菌水悬浮保存法

①将灵芝菌种培养于试管或培养皿中。

②将蒸馏水装入三角烧瓶或试管内,杀菌备用

③取菌落外围0.5厘米以内的菌丝块,约0.5厘米见方大小,丢入无菌水内,放入4冰箱保存。

3、几种菌种保存方法的比较

方法

优点

缺点

保存年限

继代培养法

1、使用方法简单

2、不需特别设备

1、生理活性降低

2、容易发生变异

室温半年以内

4一年以内

液体石腊覆盖法

1、减缓代谢反应

2、防止菌体干燥

1、遗传稳定性差

2、长期活性降低

一年以上

无菌水悬浮法

1、操作方法简便

2、活化步骤简单

1、水分容易蒸发

2、适合短期保存

10~15半年

冷冻干燥法

1、容易运输销售

2、节省空间浪费

3、安全稳定性高

适用菌种有限

4~40

超低温保存

1、安全稳定性高

2、保存期限很长

3、适用各种菌种

1、设备耗材昂贵

2、冰晶造成伤害

4~5年以上

某些菌10年以上

灵芝菌种的保存工作,除了保存灵芝的遗传和生理性质不变,还可利用原生质体融合和基因工程的技术,改良菌种。

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