灵芝属的鉴定系统

作者:lingzhi 发布于:2013-2-22 14:11 分类:简介

(一)灵芝的酯酶同工酶的分析

同工酶是基因的直接表达者[5]。随着对同工酶的结构功能、基因表达、染色体基因定位等研究的深入开展,同工酶技术被成功地应用于研究鉴定各类植物种质资源的地理起源、分类等。近年来在真菌菌种的鉴定工作中也得到了应用。

不同灵芝菌株及酯酶同工酶酶谱的差异主要表现在酶带数和Rf值上。

 不同菌株灵芝酯酶同工酶的Rf[5]

酶带号

灵芝1

灵芝2

灵芝3

灵芝4

灵芝5

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

0.3118

0.5412

0.5967

0.6261

0.6971

0.7947

0.9214

 

 

 

 

0.3118

0.5412

0.5967

0.6261

0.6591

0.6977

0.7553

0.8048

0.9062

0.9506

 

0.3952

0.4284

0.4548

0.5412

0.5967

0.6591

0.6971

0.7553

0.8048

0.9062

0.9506

0.3118

0.5412

0.5967

0.6281

0.6971

0.7947

0.9214

 

 

 

 

0.5412

0.5967

0.6281

0.6515

0.6971

0.7947

0.9214

 

 

 

 

 

同工酶的遗传行为一般是符合孟德尔规律,双显性表达方式,有完全的外显率,致使基因表达完全外显。不同于形态、形状那样,易受环境和压力的影响。所以同工酶是一个很方便而有用的遗传标志。它们是基因的直接表达产物。

在利用同工酶进行真菌分类研究中,要注意同工酶基因、基因型、基因表达时间和空间位置以及可能因素的影响。当然,还要注意在测定过程存在的丢失现象。

(二)核糖体RNA基因核苷酸序列分析

1980年代开始的分子生物学为物种分类开辟了一个新途径。目前常用核糖体RNA基因(ribosomal RNA gene)作为分子生物学分类的指针[6],这是由于其复制数目很高,并且每一单位的r-RNA基因均具有保留区(conserved region)和可变区(variable region)搀杂分布。在探讨高级分类关系时,保留区的核苷酸序列具有辨别科或属的专一功能,而可变区的核苷酸序列则有助于种间的区别。1985年用聚合酶链反应(polymerase chain reaction; PCR)大量复制特定片段DNA的方法问世后,利用引物(primer)来扩增微量模板的DNA成为大量复制的DNA片段后,再利用rRNA基因来比较标本或菌株间的亲源关系,则克服了从前两者无法互相验证的困难,为真菌分类与种源探讨开辟了另一个新领域。

许瑞祥[4]45株属于不同亚属的灵芝属菌株中找寻可以区别类缘关系的指标,结果显示由核糖体基因片段中的特定区域ITS-1ITS-2D-2可以做为灵芝属菌种间辨认的指标,其中D-2的核酸序列可以辨别灵芝属或非灵芝属,而ITS-1ITS-2的核酸序列可以做为灵芝属中种间的分类依据。将各区域所得的核酸序列经电脑程式分析结果显示,灵芝属(Ganoderma)和假芝属(Amauroderma)为类缘最近独立的不同属。在灵芝属内的树舌亚属(Elfvingia)和灵芝亚属(Ganoderma)间亦有明显的不同。

在同种的确认上,分析同属于G. lucidum complex中的各菌种都有不同的类缘关系,其中显示北美地区的G. lucidum菌株与亚洲地区的G. lucidum显然和欧洲地区的G. lucidum为不同的物种。最接近于欧洲地区G. lucidum的竟然是在阿根廷所命名的G. oerstedii

(三)随机扩增基因的多态性图谱(RAPD

随机扩增多态性DNARAPD)是20世纪90年代发展起来的DNA分子遗传标记技术,它是通过分析DNA经以随机引物的PCR扩增后显示的多态性来分析基因组DNA不同区域表现出的保守或变异特性:

由于同种菌株的核糖体RNA基因中的D2ITS区域的核苷酸序列几乎完全相同,因此无法辨认同种间不同品种的菌株,为寻找品种间遗传组成的差异,许瑞祥等利用随机扩增基因(Random Amplified polymorphic DNA; RAPD)的多态性图谱来比较各品种间全基因组成上的差异性。结果显示,以核糖体RNA基因核苷酸序列相似所归纳的同种菌株间,可以利用随机扩增全基因的多态性图谱进行个别种的标示。以分子生物技术来探讨灵芝属内异种间或同种内的分类模式,将有助于解决以前命名的混淆以及文献中研究成果间的矛盾现象。

(四)Mn-SOD基因核苷酸序列分析[4][6]

针对灵芝属菌株培养液中超氧化物歧化酶(superox-ide dismutase, SOD)的活性分析结果发现,灵芝属菌株的超氧化物歧化酶活性较一般真菌为高。许瑞祥等探讨了灵芝属来源的超氧化物歧化酶Mn-SOD基因组成的特性,并于1996年完成第一条担子菌纲的Mn-SOD基因核苷酸序列(基因数据库登录号码u56127),根据此序列设计引物进行灵芝属菌株Mn-SOD基因的扩增反应。预计的聚合酶链反应产物约为426bp,但实际所获产物介于692bp900bp之间,经定序分析所得的基因确实为Mn-SOD,并发现含有2段内含子 (intron),其中内含子I的长度介于65~103个核苷酸之间,而内含子II的长度为181~284个核苷酸。虽然在30株不同菌株间的内含子长度有差异,但是其插入的位置完全相同。分析各菌株Mn-SOD基因中表达序列(exon)部分时,显示在不同菌株间其表达序列的相似性高,长度皆为426个核苷酸,可以衍生出142个氨基酸,并且包括Mn-SOD几个重要的氨基酸。比较表达序列的长度可见,Mn-SOD基因中的两段非表达的内含子在不同菌株间其差异性极为显著,将此Mn-SOD基因核苷酸序列经PAUPphylogenetic analysis using parsimony)程序统计分析结果显示,在Mn-SOD基因中包含区别灵芝属、种与品种的个别核苷酸序列(见图3-1,图3-2)。同时将Mn-SOD基因分析所得的系统演化关系图与前述核糖体RNA基因分析所得的结果进行比较。经Mn-SOD基因分析所获结果中,不但能区别种间的差异,而且亦能进一步区分同种菌株间彼此的亲疏关系。因此无论以核糖体RNA基因或是以Mn-SOD基因所建立的分类系统均显示灵芝属中具有与假芝属(Amauroderma)及拟层孔菌属(Formitopsis)等明显不同的核苷酸序列保留区。在核糖体RNA基因中,由于其复制的数目较多,因此单一核苷酸突变时不容易被发现。然而在Mn-SOD基因中,复制数目较少,在不影响正常生理功能时,Mn-SOD基因中的部分核苷酸序列的改变,相对的较容易被保留下来,能较真实的记录灵芝属中各菌种的演化历史。许瑞祥的实验结果指出在灵芝属分子生物学分类指针的选择上,Mn-SOD基因会比一般常用的核糖体RNA基因更为合适。Mn-SOD基因核苷酸序列可同时作为不同分类层次(taxonomic levels)的分类指针,即灵芝属与非灵芝属间、灵芝属内异种间与灵芝属同种但不同品系间分类的指针。因一般真菌类的基因中,由于其内含子的核苷酸序列变异太大而很少被用于分类指针。但灵芝属Mn-SOD基因中的内含子则可作为灵芝属系统演化的指针,并据此推测灵芝属是较晚形成的新物种。

标签: 灵芝 鉴定

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